献给初学者：常用的细胞膜凋亡检测方法

在实验当中经常必须验证细胞内的抑止可能会，这里回顾了几种常见于的抑止验证定量律条文，希望并能帮到你。

一细胞内抑止的亲缘验证

引发抑止的细胞内在其本质上有一定的特质。

光学全像和倒置全像

并未染细胞内：抑止细胞内的棒状积增大、结构设计上，细胞内薄膜相比较简单但再行次出现发泡现像，细胞内抑止中晚期可见抑止小棒状。贴壁细胞内再行次出现皱缩、变圆、挤压。

染细胞内：近似于姬姆萨染、瑞氏染等。抑止细胞内的染质油脂、被忽视，质子薄膜催化、染质分割如此一来块管状和抑止小棒状等迥然不同的抑止其本质。

激光全像和共展示出激光扫描全像

一般以细胞内质子染质的亲缘改变为指标来硬照细胞内抑止的进展可能会。

近似于的 DNA 抗体原料有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三种原料与 DNA 的借助于都是非低性能的，主要借助于在 DNA 的 A-T DNA区里。紫外线照射随之而来时发射器暗淡的深蓝色激光。

Hoechst 是与 DNA 特异借助于的活命性原料，存放水银用麦芽糖配如此一来 1 mg/ml 的蒸发度，运使用时用 PBS 混合物，自是蒸发度为 10 μg/ml。

DAPI 为半通透性，使用基本上浮动细胞内的染。存放水银用麦芽糖配如此一来 1 mg/ml 的蒸发度，运使用自是蒸发度一般为 10 μg/ml。

结果硬照

细胞内抑止全过程当中细胞内质子染质的亲缘改变分为三期：Ⅰ 期的细胞内质子方形海螺管状（rippled）或方形折缝样（creased），大部分染质再行次出现油脂管状况；Ⅱa 期细胞内质子的染质低度汇聚、被忽视；Ⅱb 期的细胞内质子催化为碎块，导致抑止小棒状（图 1）。

反射电子全像推论

结果硬照

抑止细胞内棒状积增大，细胞内质油脂。抑止Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞内质子内染质低度伸长，再行次出现许多特指气穴现像（citations）的空泡结构设计；Ⅱa 期细胞内质子的染质低度汇聚、被忽视；细胞内抑止的中晚期，细胞内质子催化为碎块，导致抑止小棒状（图 2）。

二Annexin V 法律条文

甘油氨基选择性（Phosphatidylserine, PS）短小时位于细胞内薄膜的前端，但在细胞内抑止的中晚期，PS 可从细胞内薄膜的前端翻转到细胞内薄膜的表面，漏出在细胞内外环境当中（图 3）。Annexin-V 是一种聚合度为 35～36 KD 的 Ca2+ 依赖性甘油借助于复合物，能与 PS 低张力抗体借助于。将 Annexin-V 利用激光素（FITC、PE）或 biotin 记号，以记号了的 Annexin-V 作为激光探针，借助流式细胞内星象或激光全像可验证细胞内抑止的引发。

碘化丙啶（propidine iodide, PI）是一种质子酸原料，它不必利用相比较简单的细胞内薄膜，但在抑止当中中晚期的细胞内和至死细胞内，PI 并能利用细胞内薄膜而使细胞内质子红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配运使用，就可以将抑止以前中晚期的细胞内以及至死细胞内区里基本上来。

定量律条文

微粒细胞内的染：将短小时养如此一来和抑止抑止的微粒细胞内（0.5～1×106）用 PBS 浴 2 次，重新赞入 100 μl Binding Buffer 和 FITC 记号的 Annexin-V（20 μg/ml）10 μl，固棒状避光 30 min，再行重新赞入 PI（50 μg/ml）5 μl，避光中间体 5 min 后，重新赞入 400 μl Binding Buffer，立即用 FACScan 利用流式细胞内妖术计量验证（一般不最多 1 h）， 同时以不赞 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为形容词对照。

贴壁养如此一来的细胞内染：再行行用 0.25% 的胰酶消化，浇、染和比对同微粒细胞内。

丢下片细胞内染：同上，最后用激光全像和共展示出激光扫描全像利用推论。

结果

简要

1. 整个系统设计肢体要适度轻柔，切勿轻轻吹打细胞内。

2. 系统设计时注意避光，中间体完后尽快在一天内内验证。

三细胞内薄膜位能的验证

细胞内在细胞内抑止的全过程当中起着中转站效用，多种细胞内抑止诱因因子可借抑止相同的细胞内引发抑止，而细胞内跨恒定（Δψm）的增低，被认为是细胞内抑止级联中间体全过程当中最以前引发的意外事件，它引发在细胞内质子抑止特质（染质油脂、DNA 挤压）再行次出现之前，一旦细胞内跨恒定崩溃，则细胞内抑止随之而来。

细胞内跨恒定的共存，使一些亲脂性阳离子激光原料如 Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DiOC6）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide（JC-1）、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可借助于到细胞内基质，其激光的赞强或减弱说明细胞内内薄膜碱金属的增低或提高。

定量律条文

将短小时养如此一来的细胞内和抑止抑止的细胞内重新赞入运使用自是蒸发度为 Rhodamine 123（1 mM）或自是蒸发度为 DiOC6（25 nM），JC-1（1 mM），TMRM（100 nM），37 °C 适度 30 min，流式细胞内计验证细胞内的激光风力。

简要

1. 始自是保持适度染水银当中 pH 参数的一致性，因为 pH 参数的改变将直接影响恒定。

2. 与原料超出适度的细胞内悬水银当中如果所成分复合物，他们将与大部分原料借助于，提高原料的蒸发度，激起真去极化。

四DNA 相片化验证

细胞内抑止时主要的异种特质是其染质引发油脂，染质 DNA 在质子小棒状单位之间的下部挤压，形如此一来 50～300 kbp 窄的 DNA 大相片，或 180～200 bp 整数倍的寡质子苷酸相片，在发射器光谱上展示出为正方形PET图谱（DNA ladder）。

细胞内经处理后，运使用基本上定量律条文分离出来精制 DNA，利用琼脂糖发射器光谱和溴化乙啶染，在抑止细胞内群当中可推论到迥然不同的 DNA ladder。如果细胞内量相当多，还可在分离出来精制 DNA 后，用 32P-ATP 和脱氧质子糖质子苷酸一端转移酶（TdT）记号 DNA，然后利用PET和激光自照相机，推论抑止细胞内当中 DNA ladder 的形如此一来。

大大分子染棒状 DNA 相片的量度

细胞内抑止的中晚期，染棒状挤压如此一来为 50～300 kbp 窄的 DNA 大相片。所有最多一定聚合度一般来说的遗传物质 DNA 大分子在琼脂糖胶棒状当中的迁移速度相同。线性 DNA 的双螺旋圆周最多胶棒状圆周时，即超出分辨力的极限。此时胶棒状不再行按聚合度的一般来说来筛分 DNA，DNA 像通过马尔季尼夫卡一样，以其一端指向线圈一极而通过胶棒状，这种迁移模式称作「丢下行」。因此，细胞内抑止中晚期导致的 50～300 kbp 窄的 DNA 大相片不必用一般来说的琼脂糖发射器光谱来分离出来。

通常运使用脉冲PET核心技妖术可圆满地解决这一疑虑。这个定量律条文是在胶棒状上外赞正交的交变脉冲线圈。每当线圈侧向改变后，大的 DNA 大分子之后滞留在丢下行管当中，直至取而代之线圈轴向重新定向后，才能继续向前飘移。DNA 聚合度越大，这种烷基化所必须的小时就越窄。当 DNA 大分子变换侧向的小时小于激光周期时，DNA 就可以按其聚合度一般来说基本上。

DNA Ladder 量度

定量律条文

进帐细胞内（1×107）溶→细胞内催化水银→13 000 rpm ×5 min→收集上清代，赞 1% SDS 和 RnaseA（5 mg/ml）56 °C，幼鸟 2 h→酵素 K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h→1/10 棒状积 3 mol/l 醋酸钠和 2.5 倍棒状积的冷无水混合物溶 DNA，4 °C 住处→14 000 rpm×15 min→最后将溶蒸发在 TE buffer 当中，赞 DNA Loading Buffer→1.2% 琼脂糖发射器光谱，EB 染并照相。

结果

抑止细胞内 DNA 所含量的流式细胞内计比对

定量律条文

收集细胞内→70% 冷混合物（PBS 混合物）4 °C 浮动住处→PBS 浇，1 000 rpm × 10 min→RNase A（0.5 mg/ml）37 °C 消化 30 min→PI（50 mg/ml）染，固棒状避光 15 min→FACScan 比对 DNA 亚二倍棒状的形如此一来及细胞内周期的改变。

结果

ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay

结构上：敏感度低，适于验证少量样本，小大部分抑止细胞内。如针灸活命组织验证。

五TUNEL 法律条文

细胞内抑止当中，染棒状 DNA 遗传物质挤压或单链挤压而导致大量的粘性 3'-OH 一端，可在脱氧质子糖质子苷酸一端转移酶（TdT）的效用下，将脱氧质子糖质子苷酸和激光素、过氧化物酶、溶激酶或生物素形如此一来的萘记号到 DNA 的 3'-一端，从而可利用抑止细胞内的验证，这类定量律条文特指脱氧质子糖质子苷酸一端转移酶抑制的第二道一端记号法律条文（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。

由于短小时的或以前就游离的细胞内依然并未 DNA 的挤压，因而并未 3'-OH 形如此一来，相当多并能被染。TUNEL 实际上是大生物核心技妖术与亲缘相借助于的研究课题定量律条文，对相比较简单的单个抑止细胞内质子或抑止小棒状利用原位染，能准确地中间体细胞内抑止迥然不同的生物学和其本质特质，可使用矿物油包埋组织基底、溢出组织基底、养如此一来的细胞内和从组织当中分离出来的细胞内的细胞内其本质量度，并可验证出极少量的抑止细胞内，因而在细胞内抑止的研究课题当中被广泛运使用。

六Caspase-3 活命性的验证

Caspase 表亲在抑制细胞内抑止的全过程当中起着非常重要的效用，其当中 Caspase-3 为关键的可执行大分子，它在抑止接收器表征的许多途径当中充分发挥功能。Caspase-3 短小时以酶原（32 KD）的形式共存于胞浆当中，在抑止的中晚期之前，它被激活命，酪氨酸的 Caspase-3 由两个大位点（17 KD）和两个小位点（12 KD）一组，催化相应的胞浆胞质子位点，最自是导致细胞内抑止。但在细胞内抑止的中晚期和至死亡细胞内，Caspase-3 的活命性显著增低。

Western blot

比对 Procaspase-3 的酪氨酸，以及酪氨酸的 Caspase-3 及对位点多聚（ADP-质子糖）聚合酶（PARP）等的催化。

定量律条文

收集细胞内→PBS 浇→抽提细胞内催化水银→复合物计量→SDS-PAGE PET→纤维素薄膜或 PVDF 薄膜转移→5% 脱脂阻塞，固棒状 1.5～2 h 或 4 °C 住处→Caspase-3 多抗或单抗固棒状中间体 1～2 h 或 4 °C 住处→TBS-T（所含 0.05% Tween 20 的 TBS）浴 3 次，5～10 min/次→HRP-记号的鸡抗鼠 IgG 或 AP 记号的鸡抗鼠 IgG 固棒状中间体 1～2 h→ TBS-T 浴 3 次， 5～10 min/次→ECL 照相机或 NBT/BCIP 盐类。

结果

激光光学光度计比对

酪氨酸的 Caspase-3 并能特异大块 D1E2V3D4-X 位点，歧化 D4-X 聚合。根据这一结构上，设计出激光物质多肽的短肽 Ac-DEVD-AMC。在阴离子多肽时，AMC 不必被随之而来激光，短肽被歧化后释放出 AMC，权利的 AMC 才能被随之而来发射器激光。根据释放的 AMC 激光风力的一般来说，可以量度 Caspase-3 的活命性，从而解读 Caspase-3 被酪氨酸的程度。

定量律条文

进帐细胞内短小时或抑止细胞内→PBS 浇→合成细胞内催化水银→赞 Ac-DEVD-AMC（caspase-3 激光位点）→37 °C 中间体 1 h→激光光学光度计（Polarstar）比对激光风力（随之而来光波窄 380 nm，发射器光波窄为 430～460 nm）。

结果

流式细胞内妖术比对

定量律条文

进帐细胞内短小时或抑止细胞内→PBS 浇→赞 Ac-DEVD-AMC→37 °C 中间体 1 h→UV 流式细胞内计比对 Caspase-3 阳性细胞内数和超过激光风力。

结果

七TFAR19 复合物强调和细胞内展示出比对

TFAR19（PDCD5）是由本研究课题室在国际上首再行行报导的一个具备自己著作权的本能新基因，末期的功能研究课题证明，它是促进细胞内抑止的赞强剂。借助激光素（FITC）记号的 TFAR19 类似物为探针，对细胞内抑止全过程当中 TFAR19 复合物的强调总体及展示出研究课题发现，抑止中晚期 TFAR19 强调总体增低并再行次出现快速质子长号现像，随之而来着细胞内质子亲缘的改变，停滞较窄小时，在抑止小棒状当中仍然可见。

同时我们发现，抑止中晚期 TFAR19 复合物的质子长号以前于甘油氨基选择性（PS）弓形和细胞内质子 DNA 的相片化，提示 TFAR19 复合物的质子长号是细胞内抑止越来越中晚期引发的意外事件之一。进一步的研究课题证明，抑止中晚期 TFAR19 的质子长号具普遍意义，相同细胞内抑止中晚期均再行次出现 TFAR19 低强调和质子长号。这为研究课题细胞内抑止中晚期所引发的意外事件，包括了一种取而代之核心技妖术和指标。

TFAR19 复合物的细胞内展示出比对

碳化催化剂

FITC 记号的类似物，pH 7.4 、0.15 mol/L PBS，3% 的多聚甲醛，PBS-T（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 所含 0.2% Tween 20），胎牛人棒状内，激光细胞内浴水银（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 所含 2% 胎牛人棒状内及 0.1% NaN3），FACS 管，Tip 头，移水银器。

的设备

高温总体离心机，37 °C 水浴箱，激光全像，共展示出激光扫描全像，流式细胞内星象。

定量律条文

1. 微粒细胞内的染

（1）进帐短小时和抑止抑止的细胞内（0.5～1×106），PBS 浴 2 次，1 000 rpm×10 min。

（2）3% 多聚甲醛冰浴 10 min，PBS 浴 2 次，1 000 rpm×10 min。

（3）重新赞入 PBS-T 溶水银，37 °C 幼鸟 15 min，PBS 浴 2 次，1 000 rpm×10 min。

（4）重新赞入 200 ml 胎牛人棒状内，固棒状中间体 30 min。

（5）重新赞入 5 ml FITC 记号的 TFAR19 单抗（自是蒸发度为 1:40），4 °C 中间体 30 min。

（6）激光细胞内浴水银浴 2 次，1 000 rpm×10 min。

将细胞内溶滴片，激光全像及共展示出激光全像下推论 TFAR19 在细胞内当中的展示出。同时用流式细胞内星象计量验证 TFAR19 复合物的超过激光风力。

2. 贴壁细胞内的原位染

（1）贴壁生窄的乘积期细胞内石刷在 24 下端或 6 下端刷当中（环绕着无害盖玻片），让其丢下片生窄，待窄到 50%～80 % 满时，抑止抑止剂处理细胞内。

（2）将相同小时点处理的细胞内利用免疫激光染，染迭代同上。

（3）将染的丢下片细胞内放于一张滴有少量（5 ml）的载玻片上，激光全像或共展示出激光扫描全像推论 TFAR19 在细胞内当中的展示出。

3. 针灸病理基底的染、验证

4. 原代细胞内的养如此一来、验证

5. 比对 TFAR19 复合物在人棒状内各组织器官的分布区里及展示出

TFAR19 复合物的强调与针灸疾病

ELISA 法律条文验证短小时人和疾病管状况下，以及疾病的相同时期，人棒状内当中 TFAR19 复合物总体及其 TFAR19 自身突变总体。

碳化和催化剂

1. 包被 Buffer：pH 9.6， 0.05 mol/L 碳酸盐 Buffer

2. 浇水银： pH 7.4，0.15 mol/L PBS 所含 0.05% Tween 20

3. 阻塞水银： 3% BSA（用浇水银代替品）

4. 酶标突变的混合物：用阻塞水银混合物

5. OPD 位点 Buffer：Na2 HPO4·12 H2O 1.84 g，苯甲酸 0.51 g，DDW 100 ml

6. 盐类水银（现配现用）：位点 Buffer 10 ml，OPD 2 mg，30% H2O2 2 ml

7. 自是止水银 2 mol/L H2SO4

8. 重组人 TFAR19，HRP 记号的鸡抗人 IgG9 ELISA 刷，Tip，移水银器，ELISA Reader（OD 490 nm），浴刷机

系统设计迭代

1. 用包被 Buffer 混合物的重组人 TFAR19（1 mg/ml）包被 ELISA 刷，100 ml/well，37 °C 幼鸟 2 h 或 4 °C 住处（一般 24 h 以上）。

2. 浇 Buffer 浴刷三次，重新赞入阻塞水银，200 ml/well ， 37 °C 幼鸟 2 h 或 4 °C 住处。

3. 浇 Buffer 浴刷三次，重新赞入相同混合物度的医护人员人棒状内（3 个重复下端）100 ml/well ，37 °C 幼鸟 1 h。设包被 Buffer、浇 Buffer 、阻塞水银为形容词对照。

4. 浇 Buffer 浴刷三次，重新赞入 1:2 500 混合物的 HRP 记号的抗人 IgG， 100 ml/well，37 °C 幼鸟 1 h。

5. 浇 Buffer 浴刷三次，重新赞入盐类水银，100 ml/well，避光中间体 10～15 min。

6. 重新赞入 H2SO4 自是止中间体，50 ml/well。

7. ELISA Reader 读取 OD 490 光密度参数，比对和相比较医护人员人棒状内和短小时血 清代当中 TFAR19 自身突变的强调总体。

8. Western blot 比对病症细胞内和短小时细胞内的 TFAR 19 复合物的强调总体。

参考文献

Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

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